免疫组化具体步骤中的一些问题

问：

我现在刚开始做石蜡切片免疫组化,具体操作过程中有些问题想要咨询一下
1.脱蜡至水:二甲苯I II 各10分钟后 100% 95% 85% 75%酒精各多久呢（因看各个版本的介绍都不同）
弱弱的问:只搞一个浓度的酒精如95%时间稍微长一些可以吗
2.抗原修复:可以枸橼酸加热至沸腾再放入切片保温5-10分钟吗?冷却至室温这步可以将切片拿出来冷吗?
3.加一抗后37度2-3小时这步要怎么操作,切片怎样放在水浴箱呢?
4.DAB用前几天的可以吗?一定要现用现配吗?
5.苏木精复染要几分钟呢?弱弱的问一下这步的作用是什么?
另外听说这步完了在透明之前要在稀盐酸中过一下有这种说法吗?作用是什么呢?

答：

1,以后各5分钟,是搞两个浓度的酒精,如95%,因为用久了就会稀释.
2,我是这样做的:微波（MW）加热过程如下：在盒内放入200ml柠檬酸缓冲液（PH6.0±0.1），并盖上带有小孔的盖子，微波加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架中，放入已沸腾缓冲液中，采用微波炉中等功率800W,微波炉选用解冻档的国产家用微波炉（建议用医用微波炉），中档继续处理10-20分钟；取出微波塑料缸冷却至室温，从缓冲液中取出玻片，片子经蒸馏水冲洗二次，之后用PBS（PH7.2-7.4）冲洗两次，每次3分钟。
经高温后冷却这一步不能省略.个人观点，15分钟的冷却是必须的：1、如这一步省略，对于有些抗体而言，会降低AR-IHC染色强度。2、突然从高温到低温可导致组织片掉片。3、可能引起形态学的变化。（所以不要拿出来呀）
3,放入湿盒中.
4,DAB必须现用现配,并且配后30分钟内用完.
5,复染时间不等,有的30S,有的几分钟,根据组织,你自己多做几张摸索一下.作用是染细胞核.
另外,在透明之前是分化,用1%酒精盐酸,如果复染太深了,你可以分化,一般不用.
GOOD LUCK!

1）脱蜡的时候酒精的浓度要从高向低，我一般是二甲苯--二甲苯--100％酒精--100％酒精--95％酒精--80％酒精
2）抗原修复比较重要，一般是在90度以上15分钟，先把片子放进去然后加热，15分钟后让其自然冷却，也可以将抗原修复的容器放在一盆冷水里，让其环境冷却后再将片子拿出来
3）我一般一抗孵育都是放在4度冰箱里过夜
4）DAB要现配现用，在30分钟内用完，我一般DAB显色30秒，效果还可以，但具体情况还是要具体分析，在显微镜下看情况而定，但是如果超过10分钟都没有颜色的话就说明染色失败了
5）苏木素是染细胞核的，我一般染1分钟，可以自己摸索一下
6）复染后可以用1％酒精盐酸分化，通过改变其PH值来分化胞浆的颜色。然后用淡氨水返蓝。
7）如果你的片子一直不出结果，先看看自己的操作有没有问题，二抗是不是针对一抗来源的特异性抗体，如果操作各步骤都没有问题，zui先考虑的就是一抗的问题，你可以将你的免疫组化片子发来看看，大家一起讨论一下。