寻求反义分子
合理的设计和特异性使反义分子抓住了人们的想象力。不过,它们比zui初预测的难生产得多,至今尚无任何证据表明它们具有去除单一基因的功能,而且,还存在许多未预测的非反义效应。本文旨在综述反义策略中产生或破坏特异性的一些因素,讨论通过不同的标准判断治疗的复杂性及研究制剂的必要性。
反义分子是指与细胞内DNA或RNA序列相互补形成杂交体而阻断或减弱其转录和翻译过程的DNA或RNA片段。目前研究zui多的反义分子主要有反义寡核苷酸(oligo deoxy nucleotides,ODNs)和核酶。科学家们试图应用这些分子抑制目标基因从而了解它们的功能,药物开发人员则试图找到以核苷酸为基础的治疗手段。但是,当核酸药物通过目前尚未了解到的机制,作用于其它分子,而不是它的靶部位这一“非反义”效应被发现以后,反义领域被掉转了方向。非反义效应并非*有害,实际上,它们所提供的附加疗效对药物工业来说是大有益处的。不过,它们的不可预测性使得对核酸试剂的研究变得复杂起来。
一、设计合理的反义药物的障碍
有两个问题困扰着反义药物的发展,一个是核酸药物通过尚未了解的机制,作用于其它分子,而不是它的靶部位的“非反义”效应;另一个是靶RNA的内部结构及其与细胞蛋白质的相互作用而形成的物理障碍。
非反义效应使药物工业进退两难,其不可预测性使得对核酸药物的研究变得复杂起来。非反义效应并非*有害,实际上它们的附加疗效对药物工业来说是大有益处的,某些非反义ODN已被用来作为佐剂提高免疫治疗及疫苗的效能。非反义效应的复合作用机制有可能生产出集许多复合疗法为一身的单一药物。对药物来说,非反义效应也有不利的一面,它给基因寻觅者带来很大的困难。在对其作用机制一无所知的情况下,把对药物有益的非反义效应作为研究制剂来考虑时往往成为不利因素,将其用于分子生物学的研究将会是灾难性的。由于对其作用机制缺乏了解,使反义药物没计起来非常困难,也很难形成商业化,而且它们还可能成为毒性的来源。
靶RNA的内部结构及其与细胞蛋白质的相互作用使许多可能的结合部位不能与反义分子结合。当核酸药物通过Watson-Crick配对,与靶RNA的暴露区域互补且局限于此区域时,真正的反义效应才能得到增强,而不需要的反义效应才能降低,然而这种优化是很耗时的。目前有效的核酸药物必须在大批候选库中,通过流水线式的筛选才能得到。
二、对临床是否有益是检验核酸药物的标准
没有哪一种药物具有*的选择性,通常具有生物活性的化合物有许多种效应,需要用剂量—效应曲线来对化合物进行初步的药理鉴定。象对所有其它药物进行研究时所做的那们,只有了解其临床用途,以及获得了它的剂量—效应曲线的定量信息和治疗参数以后,才能判断反义药物的价值。
核酸药物的治疗作用需要经过慎重的调节,与传统药物典型的2~3个幅度范围的剂量—效应曲线相比,反义药物的曲线只局限在很窄的浓度范围内。无论在体外或在体内,1/10的量就可将产生非反义效应的浓度与产生*反义效应的浓度分开。极陡的剂量—效应曲线通常表明一个药物有多种的协同作用机制。这些治疗窗口很窄的药物可能非常有效而且极有价值,但在应用的安全性方面也较难处理。因为反义与非反义效应的比率在限定的浓度范围以外迅速下降,要获得一致的治疗结果是很有挑战性的。
三、反义药物实验标准
反义药物*的诱惑力和媒介宣传总使得反义试剂涉及到的问题变得微乎其微。当一个反义分子引起生物学效应时,很难确定这一改变是因为该制剂特异地作用于靶RNA,这是由于一些非反义效应(包括其它的楄苷酸和蛋白质)在起作用。为区分反义和非反义效应通常采用的策略是应用一个与反义寡核苷酸顺序相比已改变了的寡核苷酸,不幸的是,不是所有的非反义效应都能检测到。有些例子中采用的标准非常松,已发表的反义文章的性的评估只有50%~5%。这些调查结果强调制定更严格的质量控制标准的必要性,而且应用纯的寡核苷酸制剂的必要性也得到强调。选择性地发表一些理想(阳性)的结果逐渐受到了压力。这表明我们在进行反义研究时应保持高度的警惕性,必须同时检测较多的对照ODN,对每一个“反义”分子都需要经过不厌其烦的验证。
四、反义技术与单一基因性之间的距离
针对单一基因的能力对药物来说是困难的。在研究领域中,特异性对一个有效的实验制剂来说虽不是zui根本的,但确是一个关键的特性。随着选择性的剔除基因的手段逐渐得到改善并越来越容易操作的时候,从时间、经费及选择性等方面比较以后来考虑反义技术就显得非常重要了。
不幸的是,对反义诱导的副作用的量化性数据所知有限,大部分信息来源于反义复合物的影响仅涉及少数分子的测量,如目标靶RNA,持家基因和一些对照RNA。当一个反义分子符合以下这两种标准时,才能认为是特异的:①细胞的生存力没有大幅度的下降;②靶RNA与它所对应的蛋白水平与对照RNA相比下降得多。不过这种类型的实验在提供有关RNA和蛋白质的总体水平改变时显得很局限,它甚至不能给信号与全部的噪声比提供一个粗略的估计。这种方法的另一个缺点是不能提供有关反义分子与其蛋白质相互作用的直接信息,即使这种相互作用是反义分子产生效应的主要动力。
到目前为止,反义分子能否选择性击中单一基因还不能被证实。随着已测序的基因的增加,鉴定RNA是否有与反义分子互补的区域,以及评估反义疗法对其它无关分子的作用都是可行的。此外,还可以通过筛查mRNA库、cDNA差异展示技术或定量检测基因表达图谱的基因芯片杂交的方法来分析反义治疗带来的变化。如果这些方法可以检测出未预料到的变化,可以应用另一些技术将缺乏特异性的结果与反义反应的下游结果区分开。有关意外击中的数目以及其它基因表达的改变的相互作用本质的信息可以指导将来的药物开发。这种特异性,无论它到底是什么,一定会随着现行的策略的优化以及产生更少副作用衍生物的核酸化学的发展而大大提高。
五、特异性的理论局限性
虽然ODNs和核酶确定能击中它们的靶部位,但到目前为止,尚无任何证据表明,反义药物具有仅仅剔除一个基因的能力。理论给反义特异性提供了有用的数据。单倍体人类基因组有3×109个碱基。在这样大的随机顺序中,17或大于17个核苷酸的任意顺序仅出现一次的概率很高。为了剔除某一基因,必须将17个碱基正确匹配者从只有一个碱基错配者中区别出来。
要想知道ODN的分辨力,就必须知道它们的作用机制,这种机制可能随细胞类型的不同而不同,也可能依赖于靶RNA或ODN的特性。不过,在许多体系中,靶RNA都能因RNase h的作用而被消耗。RNase h的活性切割DNA-RNA杂交体中的RNA成分,它们并不需要长的杂交区作为底物,实际上,在体外RNase h切割的对象可以只有4个碱基对。对于标准的ODN来说,10个碱基对对人类也就足够了;在经化学修饰过的核苷酸中,少至7个碱基对就可被切割。对每一个10碱基核苷酸顺序来讲,在人类基因组中平均有3000个拷贝,因此,任何特异的10碱基出现在许多个RNA中的可能性是极大的。当一个互补于这样的一个10碱基的ODN被导入细胞时,所有含有这些10碱基的RNA都有被RNase h切割的风险。当然,并不是所有的3000个拷贝都会被切割,这是因为许多拷贝可能并不出现于转录物中,而出现在转录物中的也会有许多是RNase h无法接近的。但是,即使是3000个拷贝中的1%被击中的话,也会直接影响到30个基因。而且,有两个原因使得“风险”基因的数目数超过3000个;①典型的ODN平均含有20个或更多的碱基,每20个碱基含有11个10碱基,而每一个10碱基平均会出现3000次;②RNase h可能不需要10个连续的碱基对就能完成切割。因为RNase h只需要很小的杂交区,所以不能通过增加ODN长度来增加其特异性。实际上,由于会使错配顺序更稳定的结合,大于zui小值的长度可能会有反作用。
在对非洲爪蟾卵母细胞的研究基础上,人们发现只想让目的靶RNA被切割,而不同时发生至少是部分非靶RNA被切割的情况恐怕是不可能的。目的与非目的靶RNA被击中的比率依赖于一些复杂的因素,这些因素决定了反义分子与靶目标是否并存以及RNA内的互补部位是否被掩盖或是被分子键作用而使它们不可接近。将来,即使是反义化学的发展降低了ODN与蛋白质的结合,由RNase h导致的对特异性的限制还将存在,在评价反义策略时必须牢记这一点。
核酶对靶部位识别也是由Watson-Crick法则决定的,因此,与ODN一样,它也有类似的特异性方面的局限性。核酶通过识别不同长度的顺序与靶RNA结合。一个与靶RNA能形成较多数目碱基互补的核酶,并不比那些识别相对较短顺序的核酶具有更强的对目的靶RNA的分辨力。实际上,延长识别顺长度反而会降低核酶的分辨力。目前正在研究是否存在这样一种顺序,既短到能分辨与靶RNA相差一个碱基的RNA而使其不被切开,又长到允许一个单一的RNA可以被选择性的破坏。核酶能击中单一基因这一情况并不让人感到惊讶。大部分核酶都是槌头或发夹状分子,自然状态下,可以共价地结合在其切割部位上,自身切割病原体亚病毒(类病毒)的前体分子。为了充分起作用,核酶从同样小的RNA分子的有限数目的碱基中选择其切割部位。因此,人工合成的核酶比自然形成的核酶有更高的特异性。当然,象其它RNA一样,核酶有与细胞蛋白结合的可能性,因此,会产生显著的非反义生物学效应。
当考虑反义特异性的理论局限性时,需牢记基因组并不是一个“随机的顺序”。一个RNA中含有的“好”的反义靶顺序在另一些RNA中出现的机率会比预测的更高或更低。应用生物顺序的趋势可能会限制这种只依靠Watson-Crick互补法则的策略的特异性,随着对人类基因顺序完整数据的获得,这种倾向性会得到更细致的分析。
六、反义介导的基因剔除原则
在细胞内,不能通过体外经常采用的诸如提高温度,或改变离子强度以降低核苷酸杂交背景的策略来提高特异性。因此,需要一些其它的策略来提高细胞内的特异性。有一种方法被用来设计多重反义复合物,复合物中的每一亚单位都直接作用于同一个靶RNA的不同部位,通过分子三角关系将其消灭。除此之外,还有一些工作解决了RNA分子中所有部位不同等暴露这一问题。如果与反义ODN互补的10碱基出现在靶RNA的可接近区,又在无关RNA的被保护区,靶RNA就会被优先消耗掉。而鉴别互补于靶RNA脆性部位的反义分子是很难做到的,因为RNA是一种内部结构错综复杂的分子。
zui近的研究强调了RNA内结构限制其与ODN结合的程度。人们发现能与mRNA稳定结合的ODN极少,这些结果指出这种结合可能只发生在RNA可被接近的区域,靶RNA结构是决定反义分子特异性的主要因素。象ODN一样,核酶的靶部位的可接近的区域,靶RNA结构是决定反义分子特异性的主要因素。象ODN一样,核酶的靶部位的可接近性也有变化。细胞蛋白及核糖核酸蛋白复合物,如核糖体,会防碍核酶介导的切割作用,那种认为“核酶扩散,结合随后切割非结构RNA这种容易的过程似乎是过于简单了”。因为预测在体内RNA分子的哪一部分能被接近是很困难的,必须筛查大批候选者才能找出能在细胞内起作用的反义分子。
七、设计反分子的策略
在任何时刻,RNA固有的结构以及它们与蛋白质的结合都限制了RNA分子中可接近部位的数目,因此为特异性提供了基础。结合象一件稀有的例外事件,反义分子被排除在大多数互补部位之外。因为这种可接近性是无法预测的,合理的设计反义分子是不可能的。由于缺少设计法则,需要经过更精细的耗时、耗资过程,从20~50个候选者中选出有效的反义分子。如果说对50个分子的检测能找出好的候选者,对上千个复合物的检测会找出更好的。但如何设计它们呢?它们的顺序仅仅依靠于能与靶RNA形成线性的Watson-Crick互补呢?还是象自然存在的反义TNA一样包含切割部位?又该如何看待非规范的碱基配对作用和象茎-套这样的结构呢?
有关体外情况下ODN结合的可接近性与在体内ODN介导的反义抑制的脆弱性之间的关系正在进行探讨,而且也将成为未来研究的一个领域。还不清楚体外筛查技术是否同样能鉴别出在体内起作用的ODN。有许多可能的顺序需要选择,看起来体外研究并不总能预测在体内时的有效性,还需要开发能应用于细胞内的更新的筛查技术。
八、结论
随着许多非反义效应的作用机制的发现,以及与目标靶RNA的大部分Watson-Crick结合部位不可接近这一特点,使zui初产生的关于ODN和核酶非常容易设计以及它们可以选择性地作用于靶部位这类观点受到了动摇。筛查大批的候选反义分子及核酶,以及对体内效应的精心观察既费时又费钱,这增加了用它们作为遗传探针的困难。虽然关于它们的特异性尚存疑问,还具有越来越多的证据表明反义分子作为一种药物工具是有用的。而且,某些非反义效应也是有治疗价值的,值得进一步探讨。因为非反义效应目前尚不能预测,合理的设计法则还不能应用在非反义药物的生产中,这种效应还需要逐例的进行探讨。