ELISA技术要点与常见问题分析解答
ELISA技术要点与常见问题分析解答 上海联硕生物科技有限公司 在ELISA实验前的注意事项 1 仔细阅读说明书 2 确定试剂盒在有效期内 3 按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积） 4 标本制备要规范，每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备（贮存），尽量分装做备份。短期内无法实验者，注意低温保存 5 准备好所有实验额外所需物品，如试管、吸头、移液器、离心机等 6 根据检测标本数量确定所需试剂的量 7 按说明书将所用试剂平衡至室温，配制所需试剂 DIY夹心法ELISA常见技术指南 8 选择抗体时选择一个单抗和一个多抗进行配对；若选择两个单抗，必须识别不同表位的抗体；从同一家公司选择抗体对。 9 ELISA实验中为了确定*信号和zui低背景应将捕获抗体（0.5-4μg/ml）和检测抗体（0.25-2μg/ml）在预实验中进行彼此相抗的滴定。同时，应包括在适当范围内的标准品的系列稀释。按试剂说明书常规提供的范围进行操作。 10 标准品的配制：对于每种细胞因子应仔细阅读说明书，注意每批的细节。在使用细胞因子前，瞬时离心试剂瓶，尽可能多地收回其中的细胞因子。根据每批说明书中的细节，将冻干的细胞因子复溶。 11 一般待测抗原标准曲线的线性范围的可通过将标准品做8次2倍系列稀释从2000pg/ml 到15pg/ml。可利用标准的ELISA操作流程、放大试剂盒、第三类试剂、或改变酶底物系统可在一定范围内提高灵敏度。 12 为了优化灵敏度，建议过夜孵育标准品和标本。 13 若使用过氧化物酶作为显色系统，应严禁在洗液和稀释液中加叠氮钠，叠氮钠可抑制过氧化物酶的活性。 14 当测定混合液体中的抗原时，如血清，建议在标本稀释液中加不相干的Ig. ELISA常见问题及处理对策 问题 可能原因 解决方法 无颜色 试剂孵育的时间没有按说明书操作。 确定生物素化抗体，连接的HRP试剂或链霉亲和素-HRP使用的时间是否适当。 不同试剂盒或不同批号的试剂混用。 重新检查试剂的标签，确准所有组分都属于正使用的试剂盒中的。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。 漏加酶 检查操作流程，注意不要漏加 HRP酶污染了叠氮钠 使用新配制的试剂，禁含叠氮钠 标准品有问题（若在标本孔中有信号） 按说明书检查标准品的制备使用1瓶新标准品 某一容器未洗净,残留灭活酶物质 尽可能用试剂盒内容器,另觅一定要洁净、可靠 使用含血清的缓冲液配制/复溶抗体 重新确认所选用的试剂 .漏加显色剂A或B 加显色剂后观察一下液面高度 试剂配制/使用有误 将实验重做；严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签。 缓冲液污染 配制新新鲜的缓冲液 显色弱 超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。 检查产品的有效期 加入试剂的体积和时间有误 确定所使用的每一个试剂的体积正确的和加入的时间是适当的。 试剂、样品用前未能平衡 用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右 缩短孵育时间能使实验的信号变弱。 检查孵育的时间。 在温度变化的环境内孵育酶标板。 确定孵育的温度，应避免温度的变化。 使用了被污染的试剂 检查试剂是否被污染。 标准品/标本制备方法不规范 检查标准品/标本的制备，标准品应按说明书进行复溶和稀释。低温贮存的标本避免反复冻融，严禁使用溶血标本。样品用 NaN3防腐,抑制了酶的反应 显色底物制备不规范 检查底物的制备，如体积是否正确，混合是否恰当充分。 检测时间不当 是否在规定的时间内检测。 仪器设定不正确，滤光片不匹配。 仪器是否设定正确，滤光片的使用等。 高背景（本底） 洗涤操作不规范 洗板不充分，使用手工洗板常出现。使用洗板机，或使用洗瓶洗涤。每孔应*充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。若使用洗板机，应校准并设定足够充满每孔的体积量。板的内侧不应接触设备。检查每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确。在两次洗板之间加30秒的浸泡。 实验中孵育温度和时间不适当 确定每一实验步骤的孵育温度和时间是否适当 酶加量过多 加酶前验看移液器调节量是否准确。检查稀释度，若必要进行效价测定。 封闭不* 检查封闭液的计算量；提高封闭时间。 标本或标准品中的干扰物质 做适当的对照 显色剂受光照时间较长,或污染 显色剂A和B应于使用前10分钟从冰箱取出 整批样品放置时间过长,样品污染 样品应保持新鲜,或低温保存,防止污染 缓冲液污染 制备新鲜的缓冲液 吸头重复使用,未洗净或消毒不*而用于加酶或显色剂 吸头尽可能一次性使用 太多的信号：全部的板子变成规则的蓝色 不充分的洗涤/洗涤步骤被遗漏-没结合的过氧化物酶仍有残留。 使用洗板机充分洗涤检查孔内是否有残留的洗液或加样量是否准确。 底物溶液混合太早并转成蓝色 应控制底物混合的时机并立即使用 太多的酶结合物 检查稀释度，必要时进行效价测定 封板膜或试剂容器被重复使用，导致HRP残留，使TMB底物产生非特异蓝色。 使用新鲜的封板膜，每步使用不同的试剂容器 缓冲液中污染金属或HRP 制备新鲜缓冲液 高CV值（CV：coefficient of variation），花板 操作不慎或洗涤不充分 按说明书洗板、加样、显色。洗板尤为重要，如上所述 出现干板，没有使用封板膜、封板膜重复使用 确定每两步骤间，酶标板应保持湿润。使用封板膜封口，注意每步使用新鲜的封板膜。 由于操作失误或板子质量差（结合不均匀）造成包板不均匀。 稀释用的PBS中不要加其它蛋白检查包被和封闭液体积、时间和试剂加入的方法。 检查所使用的酶标板，使用ELISA板子（不要使用组织培养板） 移液器不准确，吸头重复使用。 检查并校准移液器。每次取样必须换吸头。回顾标本的加入步骤，确保每次加样的准确性，保证吸取的液体按所设定的体积吸入和排出，连续加样时注意检查吸头，确保所加液体的体积。 样品离心处理不全,反应孔内发生凝血或残留细胞成分 标本充分离心, 3000rpm 6分以上，严禁使用凝血（溶血）的标本 缓冲液污染 制备新鲜的缓冲液 标准曲线可得到，但两点之间区别很差（低或平的曲线） 酶结合物不足 检查稀释度，必要时进行效价测定 捕获抗体没有很好结合到板上 检查所使用的酶标板，使用ELISA板子（不要使用组织培养板）稀释用的PBS中不要加其它蛋白 检测抗体不足 检查稀释度，必要时进行效价测定 板子显色不足 延长底物孵育实验使用推荐品牌的底物溶液 操作不慎 回顾ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。 标准曲线稀释度计算有误 核查计算的情况，制备新的标准曲线 标准曲线很好，但是没有任何期望的阳性信号产生 在标本中无相应的细胞因子 使用内参对照重复实验，重新考虑实验的相应参数 标本基质遮盖检测 将标本至少做1∶2相应的稀释，或进行系列稀释观测它的恢复性 标准曲线很好，但是标本的判读值很高 标本中含的细胞因子水平超过实验范围 将标本做稀释并再次实验 当使用HRP酶结合物时，TMB底物加终止液后显绿色 孔中的试剂显色不充分 轻轻振荡板子 边缘效应 工作环境温度不均衡 避免将板子在变化温度环境中孵育 漂移 实验过程中出现间断 整个实验应连续操作：在实验开始前将所有标准品和标本做适当的准备 试剂没有按说明书平衡至室温 在所有试剂加入孔前，确保它们已平衡至室温，除非说明书中有另外的要求。 是否可更改试剂盒 所提供的实验操作步骤？ 一般厂商为确保zui高的灵敏度和特异性，对试剂盒都进行了优化，为确保每一试剂盒实验的规范性应按说明书操作。 是否可混用不同试剂盒中的试剂？ 不行。绝大多数试剂在每批试剂盒中是特异的，若有问题可与厂家或代理商。 是否可增加或减少标本的体积。 商品化的试剂盒所需加入的标本体积是优化的，应按说明书操作，不建议更改所加标本的体积。 是否可重确定自己的标准曲线的点？ 可以。说明书上有建议的制备标准曲线时标准品的稀释度，可改变稀释倍数和增加曲线的点，但是必须在实验范围内，高于试剂盒中zui高标准品的点和低于灵敏度以下的点是无效的。
