1、冰冻切片固定

冰冻切片37℃烘烤10至20分钟，控干水分，置于4%多聚甲醛固定30min。于PBS缓冲液中晃动洗涤3次，每次5分钟。

2、抗原修复

将切片浸没在升满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盆中，置于微波炉内进行抗原修复，修复条件：中火8min至沸——停火8min保温——中低火7min（整个过程需防止修复液过度蒸发，切勿干片。

自然冷却后，将切片置于PBS缓冲液中。然后在摇床上，晃动洗涤3次，每次5min。

3、画圈血清封闭

切片稍甩干后，用组化笔在组织周围画圈，滴加组织自发荧光淬灭剂A液，室温孵育30min，纯水洗5分钟，接着滴加BSA牛血清白蛋白，封闭30min。

4、加一抗

轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按比例配好的一抗后，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜，这里推荐使用生科云选一抗实验效果更佳。

5、加二抗

切片浸没在PBS缓冲液中，然后在生科云选摇床上，晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后，滴加生科云选荧光二抗，覆盖组织，避光室温孵育50min。这里推荐使用生科云选二抗实验效果更佳。

6、DAPI复染细胞核

切片浸没在生科云选PBS缓冲液中，晃动洗涤3次，每次5min。甩干后，在圈内滴加生科云选即用型DAPI染液，避光室温孵育10min。

7、淬光组织自发荧光

切片置于生科云选PBS缓冲液中，晃动洗涤3次，每次5min。在圈内滴加生科云选组织自发荧光淬灭剂B液，避光室温孵育5min，水洗10min。

8、封片

切片稍甩干后用生科云选抗荧光淬灭封片剂封片，推荐使用生科云选配套试剂、耗材、仪器，实验效果更佳！

冰冻切片免疫荧光结果判读：

DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或绿光等。