戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

（1）0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水（PBS）：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。

（2）1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS 1ml混合。

（3）1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。

（4）0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。

（5）0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。

（6）PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。

（7）萘氏试剂及聚乙二醇（PEG，MW2000）。

（8）纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。

（9）HRP（RZ>3.0）。

（10）Sephadex G-25层析柱（2cm×50cm）。

（11）搅拌器，分光光度计，离心机。

（12）透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等

（1）称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。

（2）反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。

（3）将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。

（4）用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。

（5）加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。

（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃ 1小时。

（7）3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

（8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后（用萘氏试剂检测），10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。

（1）定性及效价滴定：用特异性抗原（或抗体）同酶标记抗体（或抗免疫球蛋白抗体）作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。zui后以直接ELISA法（或在正式实验系统里）对酶结合物进行滴定（ 见本节 （三）工作浓度的选择）。

（2）定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定（光程1cm）。

酶量（mg/ml）＝OD403nm×0.4

IgG量（mg/ml）＝（OD280nm-OD403nm×0.42）×0.94×0.62

（3）本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2-4%的酶与蛋白质结合。