在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。

（一）酶标记抗体的滴定方法：将抗原（或抗体）物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体（或抗Ig抗体）与吸附在载体上的抗原（或抗体）起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。

（二）步骤：先将抗原（或抗体）用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1%BSA-PBS液依次稀释成1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600（根据据抗体的滴度而定），分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H_２SO₄ 0.05ml终止反应。

（三） 结果判定：主要以ELISA比色仪读取各孔OD值，并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率zui大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。

1. 在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高、效价高（zui低1:16）、纯度高、亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。

2. 所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，（或必需）新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体（杂质）。否则，影响标记效果。

3. 室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。

4. 浓的标记物相当稳定，常加入30-40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1-2年，但稀释成1:10，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。