一、材料和试剂
1、0.01M PBS（pH7.4）： NaCl 8.0g； KCl 0.2g； Na2HPO4 1.44g； KH2PO4  0.24g； ddH2O至1000ml ； 高压灭菌,分装。
2、0.25%胰酶：称取EDTA 0.02g   NaCl   0.8g  KCl  0.04g  加三蒸水100ml溶解后加0.25g 胰酶,轻轻搅动,使胰酶溶解,不要产生泡沫,加酚红少许,调PH值到8.2-8.6,过滤除菌,分装10ml/管,-20℃保存,临用前预温到37℃。
3、诱导液（TPA）：12-邻-十四酰-佛波醇-13-乙酸酯（12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate,TPA）溶于丙酮，配成20mg/ml。
                                      
二、实验步骤   
（一）        、用96孔细胞培养板制备贴壁细胞抗原（正常贴壁细胞）
        1、HFF,NIH3T3细胞用含10%血清DMEM*培养液在75cm2培养瓶中单层培养,使密度达到90%
          2、倾去培养液,用无菌PBS液5-10ml洗细胞一次,用无菌吸管吸干PBS液。
           3、加0.25%胰酶（从-20℃取出,在37℃预温）75平方厘米培养瓶加1ml,37℃温箱或有经验者可在酒精灯周围,控制温度约37℃左右,轻轻摇匀使胰酶充分覆盖细胞表面。
     4、观察到细胞有松动,成流沙状下落;或在显微镜下观察,细胞已有收缩变圆时,用无菌PBS液15-20ml,终止反应。
5、轻轻吹打下细胞,使细胞单个分散,并充分混匀1500转/分离心5-10分钟,去掉上清液
  6、打散细胞,加10ml含血清DMEM*培养液混匀,取10ul在显微镜下计数,计算细胞浓度。
          7、用含10%血清培养液调整细胞浓度至1×104个/100ul,每孔（96孔）接种200ul（即2×104个细胞/孔）,37℃ CO2培养箱培养。
          8、次日显微镜下观察,细胞是否*贴壁（一般24小时可*贴壁）倒去培养 0.01M PBS液先二次（孔中加满PBS,轻轻倒掉）并在滤纸上扣干,反复3次）应 注意加液的力度,不能太大,以免冲掉细胞,倒去上清液在滤纸上扣干水份,但保持细胞湿润。
9、加90%冷丙酮固定,每孔200ul,5-10min 摔去冷丙酮,用PBS洗三次,扣干。
10、在培养板上作好标记（细胞名称,制备时间）。
11、保鲜膜封好,-70℃保存。
（二）        、悬浮细胞玻片法的抗原制备
1、 25平方厘米玻璃瓶用含10%血清的1640*培养液培养BCBL-1细胞,密度达到80-90%
2、加样枪充分吹匀细胞,收集于离心管中。
3、1500转/分离心5-10分钟,弃去上清液。
4、打匀细胞,用PBS洗二次,弃去上清。
5、打匀细胞,加少量PBS液（根据肉眼观察细胞溶液的浊度估计）混匀,取少量在显微镜下计数,调整浓度,估算在玻片上每个细胞涂片圈位 （12圈）接种细胞1×104个。
6、室温下干燥,然后加100%的冷丙酮室温固定3-5分钟,PBST洗二遍。
7、室温干燥,作好标记然后放入玻片盒 ,玻片盒用塑料袋密封,并放一袋防潮剂,-20℃保存,一个月内有效。
（三）        病毒感染细胞抗原的制备
1、96孔培养的贴壁细胞的病毒感染及病毒抗原的制备
1）        未感染细胞接种到96孔板（方法见”悬浮细胞玻片法抗原制备”1-5步）,并*贴壁。   
2）        摔去PBS液,加入少量病毒液（加入量由先做棋盘试验来确定浓度,或先测定病毒滴度而定,且病毒液用2%-5%血清DMEM*培养液稀释）,每孔50ul,摇匀,使充分覆盖细胞表面 ,37℃ CO2培养箱培养（MCMV感染NIH3T3 HCMV感染HFF）。
3）        每天观察细胞形态变化,早期CPE为细胞肿胀,中期聚集,晚期则圆缩。
4）        当圆缩细胞达到10%-30%左右,细胞层出现明显的病灶,同时还有正常细胞未感染,即可收获（一般情况下3-4天）。
5）        倒去上清（倒入有消毒液容器以防止污染环境）,用无菌PBS液洗2次（加满培养孔,倒掉,在滤纸上扣干）。
6）        倒去上清,加90%冷丙酮室温固定5-10min,每孔200ul 。
7）        摔去冷丙酮,用PBS洗三次,扣干。
8）        在培养板上作好标记（病毒抗原名称,制备时间等）。
9）        保鲜膜封好,-70℃保存。
2、BCBL-1细胞的诱导和KSHV病毒抗原的制备
<1> BCBL-1细胞扩大培养，细胞密度达到50%
<2> TPA（12-0-酰佛波醇-13-乙酸酯），每毫升培养液加40ug（TPA预先配成 20mg/ml）。
<3> 诱导三天后，收集少量细胞进行ICC预实验。
<4> KSHV阳性细胞达到10%-30%时，可做细胞涂片，阳性细胞>30%时,可用于制备病毒细胞裂解液。
<5> KSHV阳性细胞达到10%-30%时,即可收获细胞加样枪充分吹匀细胞,收集于离心管中。
<6> 2000转/分离心5-10分钟,弃去上清液。
<7> 打匀细胞,用PBS洗二次,弃去上清。
<8> 打匀细胞,加少量PBS液（根据肉眼观察细胞溶液的浊度估计）混匀,取少量在显微镜下计数,调整浓度, 估算在玻片上每个细胞涂片圈位 （12圈）接种细胞1×104个。
项目        MCMV        HCMV        KSHV
血清稀释度        1:50   1:100    1:200        1:100  1:500   1:1000        1:50  1：100   1:200
测血清用二抗       
HRP-Anti  Mouse  IgG（fc）   Sigma
或HRP-Anti  Mouse IgG+A+M   Sigma        Bio-Anti mouse IgG F（ab’）2  Sigma        HRP-Anti  Mouse  IgG（fc）   Sigma
或HRP-Anti  Mouse IgG+A+M   Sigma
测上清用二抗        Bio-Anti mouse IgG F（ab’）2  Sigma        Bio-Anti mouse IgG F（ab’）2  Sigma        HRP-Anti  Mouse  IgG（fc）   Sigma
或HRP-Anti  Mouse IgG+A+M   Sigma
<9> 室温下干燥,然后加100%冷丙酮室温固定3-5分钟,PBST洗二遍。
<10>室温干燥,作好标记后放入玻片盒,玻片盒用塑料袋密封,并放一袋防潮剂,-20℃保存,一个月内有效。

三、说明
1、        测病毒细胞ICC血清稀释度及使用的二抗


2、细胞病变作用分三种类型
1）        全变型：即整个细胞都发生改变。
<1>整个细胞都发生肿胀,胞浆呈颗粒样变,胞膜边缘不整齐。
<2>整个细胞都发生皱缩,变圆直至碎裂,脱落等,多见于病毒。
2）        包涵体型：即反映在细胞核或细胞浆内出现病毒引起的包涵体。。
3）        融合型：即指多数病变细胞发生相互事例融合而呈”巨细胞”,但单个细胞的胞核仍可分辨。
3、细胞病变程度表示方法
   通观整个”单层区”权衡总的情况,双下列符号表示其病变程度:
        无细胞病变
        +    25%以下的细胞有病变
        ++   25%-50%的细胞有病变
        +++  50%-75%的细胞有病变
        ++++ 75%-100%的细胞有病变

四、注意事项
1、病毒液应保存在-70℃,4℃保存病毒液病毒滴度会降低,保存不长久。
2、每次从冰箱取出抗原板或抗原片时,应在37℃预温去掉水雾,用前要用3%的双氧水（现配现用）除掉病毒细胞中的内源性过氧化物酶。