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影响PCR结果的因素有哪些?
  • 发布日期:2023-09-04      浏览次数:972
    • (1)引物及浓度:①长度:15~30bp。②碱基:G+C含量以40%~60%为宜,ATGC最好随机分布,避免5个以上的碱基成串排列。③避免引物内部出现二级结构、两条引物间互补,特别是3′端的互补。④引物3′端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对。⑤与其它序列无明显同源性。⑥浓度为0.1~1μmol或10~100pmol。
      (2)酶及其浓度:催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100μl时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
      (3)dNTP的质量与浓度:dNTP应为50~200μmol/L,4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),过高dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。
      (4)模板:模板的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,避免DNA纯化中的SDS和蛋白酶K等杂质。
      (5)Mg2+浓度:一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200μmol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。
      (6)温度与时间:①变性:93℃~94lmin℃,过高或过低的温度影响酶的活性。②退火:取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。一般高于Tm值5℃~10℃,时间为30~60s。③延伸:常用温度为72℃,时间根据待扩增片段的长度而定。
      (7)循环次数:主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30~40次,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。

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