琼脂糖是实验室常用的试剂之一,但是琼脂糖凝胶电泳的制备过程也不简单,接下来就为大家详细介绍一下制备过程。
一、用称量纸片电子天平取0.3g的琼脂粉;
二、配30ML的1*10的TBST缓冲液与100ml的三角烧瓶里;
三、倒入琼脂粉摇匀,并转到微波炉中加热溶解;
四、用手套取出到凉水稍稍晾凉至温热后(约60℃),加入核酸酶(Eb替代物)2ul;要边加边摇匀,使之充分摇匀;
五、取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子。
将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。
室温下静置直至凝胶凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中。
注意:制备过程中请戴好手套;梳齿处不可存在气泡,液面应保持平整无波纹。
开始跑胶
一、胶凝后取胶放到电泳槽中,倒入电泳液至浸过凝胶。
二、从冰箱中取出MARK和loading buffer,加入6ULloading buffer到样品中混匀;然后用加样枪分别加到凝胶的大孔中(要缓慢加,不要穿破凝胶,最后枪不要打尽以至于有空气使样品吹打出来);MARK加到小孔中的任一孔(记住位置)。
三、盖上电泳槽,加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动,电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低,当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳。
四、使用凝胶成像仪拍照,观察条带(mark或样品是否有条带显示)。
观察方法
电泳时间依据实验的具体要求而定,在电泳中途可以使用紫外灯直接观察,也可以根据指示剂确定条带的迁移位置,各条区分开后电泳结束,取出凝胶直接检测拍照。
拿到胶体条带图谱后,找到marker,根据marker就可以确定目标条带了。