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ELISA 材料和方法(检测猪流行性腹泻病毒抗体)
  • 发布日期:2011-10-24      浏览次数:1344
    • ELISA材料和方法(检测猪流行性腹泻病毒抗体) 

       

      1 材料 

      (1) 聚苯乙烯塑料微量组织培养板:4×10孔,上海塑料三厂生产。 

      (2) 包被液(pH值96):NaHCO3 293g、Na2CO3 195g,蒸馏水加至1 000ml,置4℃保存。 

      (3) 洗涤液(001mol/L、pH值74PBS):NaCl 80g、KH2PO402g、Na2HPO4•12 H2O 29g、KCl 02g、Tween20 05ml,加蒸馏水至1000ml。 

      (4) 保温液:牛血清白蛋白(BSA) 01g、005% PBSTween20 100ml,4℃保存。

      (5) 底物溶液(OPDH2O2

      磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH值50):02mol/L Na2HPO4(284g/L)257ml、01mol/L柠檬酸(192g/L)243ml、蒸馏水50ml。 

      底物溶液:磷酸盐柠檬酸缓冲液100ml、邻苯二胺(OPD)40mg、30%H2O2 015ml,现配现用。 

      (6) 终止液(2mol/L H2SO4):浓硫酸222ml、蒸馏水1778ml。 

      (7) 猪流行性腹泻(PED)抗原:PEDV猪胎肠原代细胞培养物,反复冻融,65℃ 30min灭活。zui后以3 000 r/min离心30min,取上清分装,-20℃保存备用。抗原的蛋白浓度为300μg/ml。 

      (8) 酶标兔抗猪抗体结合物:按郭春祥方法制备。mol/L比为196,酶结合物效价为1∶10 000。 

      (9) 被检猪血清:采自疫区猪和病猪。PEDV免疫猪血清及健猪血清分别用于阳性、阴性对照。 

      (10) 酶联免疫吸附试验检测仪:南京华东电子管厂生产。

      2 ELISA操作程序(间接法) 

      (1) 抗原包被:用包被液将PEDV抗原作1∶5稀释包被反应板,每孔100μl,同时设阴性细胞培养物对照孔,置4℃过夜。 

      (2) 洗涤:用洗涤液洗涤2次,每次2min,沥干。 

      (3) 加入被检血清:用保温液将被检血清作1∶100稀释,加入反应板相邻的两个孔中,每孔100μl。同时作阴、阳性标准血清对照,置37℃孵育1h。 

      (4) 洗涤3次:方法同上。 

      (5) 加入酶结合物:用保温液将酶结合物作1∶4 000稀释,加入反应孔中,每孔100μl,置37℃孵育1h。 

      (6) 洗涤3次:方法同上。 

      (7) 加入底物:每孔100μl,置室温暗盒内显色20min。 

      (8) 加入终止液:每孔50μl,静置5min。 

      (9) 测定OD值:用检测仪,于492nm波长,按仪器使用及制定标准要求调节仪器,测定各反应孔的OD值,记录结果。 

      结果判定凡检测血清P/N值超过14的,均判为阳性。肉眼观察,凡反应孔的颜色比正常细胞对照孔、正常血清对照孔颜色深者为阳性。 

      注意事项 

      1 在各载体中使用zui多的为聚苯乙烯塑料板。不同厂牌,甚至不同批号的反应板吸附性能往往有很大差异,因此使用前需要加以选择。方法为:在整块板上测定同一标本,求出每一对孔的平均OD值,将此值与该板的总均值相比,其差值需在±10%以内。 

      2 为了增加聚苯乙烯板对某些抗原或抗体的吸附作用,可试用鞣酸处理,牛血清白蛋白处理,改变载体的表面电荷,引入化学基团等方法处理反应板。 

      3 如非特异性吸附较强,需考虑采用封闭等方法排除。(1) 封闭:可选用4%~10%牛血清白蛋白、10%小牛血清、10%马血清、01%~25%明胶等。 

      (2) 去污剂:可阻止非特异吸附,而不影响特异性抗原抗体反应。常用的有005%~05%吐温20、吐温80、01%NP40等。 

      (3) 高盐浓度缓冲液:如含05mol/L NaCl及005%吐温的磷酸盐缓冲液(pH值80)。 

      (4) 缩短孵育时间:保温液中加入终浓度4%的聚乙二醇(PEG,MW6 000) 

      可缩短抗原抗体反应的孵育时间(20min以内)。 

      4 由于反应板可能存在边缘效应,因此测定标本时至少要取两孔的平均值。 

      5 各种常用的酶标反应比色计性能不一,测定时需根据各自的仪器确定阈值。

      上海联硕生物科技有限公司提供

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