一、 贴壁细胞传代(以一个T25瓶为例)
1、 吸出原培养液;
2、 加入2ml左右PBS,轻轻晃动培养瓶润洗细胞,吸出PBS丢弃;
3、 加入1ml左右胰酶,轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞,放入培养箱消化;
4、 消化时间跟据细胞特性有所不同,显微镜下看到细胞块中间的细胞明显分离变圆,侧立培养瓶细胞可以滑落时可终止消化,全程不要拍打培养瓶;
5、 加入3ml含血清的培养基终止消化,吹打细胞使之脱落并在液体里反复吹打使细胞,使之尽量呈单颗细胞的悬浮液,这时可以在显微镜看下;
6、 收集细胞悬液离心,1200rpm(约250g) 3分钟,离心完吸出上清丢弃。
7、 加入新鲜培养基,吹打几下混匀细胞即可,按需接种到新培养瓶,补足培养基,拧松瓶盖或使用透气瓶盖进行培养。
8、 检查培养箱二氧化碳,温度和水盘。
二、 悬浮细胞传代(以一个T25瓶为例)
1、 轻轻吹散悬浮细胞,部分贴壁松散的悬浮细胞可直接吹打培养瓶底部使细胞悬浮,收集细胞悬液到无菌离心管中,离心1200rpm(约250g) 3分钟,离心完毕吸出上清丢弃;
2、 加入适量新鲜培养基重悬细胞,按比例接种至培养瓶(接种比例按实际情况,不确定可计数后再接种);
3、 常规细胞推荐以3~5×105cells/ml传代,长到2×106cells/ml传出;
4、 建议刚开始几代计数后传代,后面可以根据经验按比例传代。
三、 半贴壁半悬浮细胞传代(以一个T25瓶为例)
1、 培养液(含悬浮的细胞):用移液器吸出培养液转移到无菌离心管中;
2、 贴壁部分:用1ml PBS洗细胞,吸出PBS放入到第1步装有培养液的离心管中收集(不要直接丢弃,里面有细胞);
3、 培养瓶加入胰酶1ml,放入培养箱静置消化;
4、 消化时间跟据细胞特性有所不同,显微镜下看到细胞明显收缩变圆,侧立培养瓶细胞可以滑落时可终止消化,全程不要拍打培养瓶;
5、 用3ml含血清的培养基终止消化,将消化下来的细胞悬液吹散细胞后收集到第1步的离心管;
6、 将离心管在1200rpm(约250g) 3min离心,离心完毕弃掉上清,加入新的培养基重悬,按实际情况分瓶,放入培养箱培养。