酶结合物的制备

    免疫酶技术（immunoenzymatic technique）又称酶免疫测定法（enzyme immunoassay,EIA）,是继免疫荧光技术和放射免疫技术之后发展起来的又一种免疫标记技术。它是把抗原抗体的特异性反应和酶的催化作用相结合而建立的。该技术通过化学方法将酶与抗体或抗抗体结合，形成酶标记物，这些酶标记物仍保持免疫学活性和酶的活性，然后将它与相应的抗体或抗原起反应，形成酶标记复合物，结合在免疫复合物上的酶，在遇到相应的底物时，则催化底物产生水解、氧化或还原等反应，而生成可溶性或不溶性有色物质。然后根据显色的深浅来反映待测样品中抗原或抗体的含量，如生成的有色物质为可溶性，则可用肉眼比色或酶标测定仪测定光密度值（OD）定性或定量；如生成的有色物质为不溶性沉淀物，同时又是电子致密物质，则可用光学显微镜或电子显微镜识别和定位。因此，免疫酶技术是一项定位、定性和定量（敏感度可达每毫升ng~pg水平）的综合技术。常用的酶是辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）。

    酶标抗体或抗抗体（抗免疫球蛋白）结合物可采用戊二醛法或过碘酸盐氧化法制备。郭春祥建立的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。现将操作方法介绍如下： 

    （一） 结合物的标记将5mg HRP溶于05ml蒸馏水中，加入新配制的006mol/L NaIO4水溶液05ml，混匀，置冰箱30min，取出加入016mol/L乙醇水溶液05ml，室温放置30min后，加入含5mg纯化抗体的水溶液（或PBS）1ml，混匀并装透析袋，以005mol/L、pH值95碳酸盐缓冲液缓慢搅拌透析6h（或过夜）使之结合，然后吸出加NaBH4溶液（5mg/ml）02ml，置冰箱2h。将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵，冰箱放置30min，离心，将所得沉淀物溶于少许002mol/L、pH值74 PBS中，并对之透析过夜。次日再离心除去不溶物，即得酶抗体结合物。用002mol/L、pH值74 PBS加至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。 

    （二） 结合物中HRP与抗体量的测定酶标结合物于751型分光光度计上分别用280及403nm波长测定其光密度（OD），并计算出OD403与OD280之比值以及HRP与抗体的mol/L比。

结合物中HRP浓度（mg/ml）=OD403×04 

结合物中IgG浓度（mg/ml）=（OD280-OD403×03）×062 

酶/抗体mol/L比=HRP浓度IgG浓度×4 

    （三） 结合物稀释度的测定

用酶结合物中抗体相应的抗原直接包被聚苯乙烯反应板，采用ELISA直接法测定酶结合物效价。通常本法制备的酶结合物作1∶10 000稀释时，其OD403仍在01以上。