BAS酶联免疫吸附试验材料和方法
(以筛选抗空肠弯曲菌共同抗原的单克隆抗体为例)
1 材料
(1) 空肠弯曲菌共同抗原提取物,自制。
(2) 生物素化羊抗鼠IgG(BSAMG),卫生部上海生物制品所。
(3) ABC试剂,卫生部上海生物制品所。如ABC试剂需自己配制,可按说明要求,将亲和素与酶标生物素按一定比例混合,置37℃孵育30min后使用。
(4) 被检杂交瘤培养物上清液。
(5) 其他试剂及器材同常规ELISA法。
2 方法ABCELISA间接法程序
(1) 用包被液对空肠弯曲菌共同抗原提取物作适当稀释(1∶16),加入反应孔中,每孔01ml,置4℃包被过夜或37℃1~2h。
(2) 用洗涤液洗涤2次,每次1min,沥干。
(3) 加入杂交瘤培养物上清液,每孔01ml。同时作BALB/C小鼠免疫血清(阳性)及正常血清和培养液(阴性)对照,置37℃1~2h。
(4) 洗涤3次,方法同上。
(5) 用保温液对生物素化羊抗鼠IgG作适当稀释(1∶400~1∶1000),加入反应孔中,每孔01ml。置37℃孵育1h。
(6) 洗涤3次,方法同上。
(7) 用ABC稀释液或保温液对ABC试剂作适当稀释(1∶100),加入反应孔中,每孔01ml。置37℃孵育30min。
(8) 洗涤3次,方法同上。
(9) 加入邻苯二胺底物溶液,每孔01ml,置暗盒内室温显色适当时间(30min)。
(10) 加入2mol/L H2SO4,每孔005ml,终止反应。用酶联检测仪检测结果,并记录其OD值。
3 结果判定以P/N≥2为阳性,或根据自定标准判定。
4 注意事项
1 ABCELISA中各要素的*反应条件需经筛选后确定,不能照搬常规ELISA的反应条件。
2 ABCELISA对抗原和抗体(或免疫血清)的质量要求高,否则可造成较高的本底或背景显色。