一、操作步骤:
1、在37℃ 5% CO2条件下将细胞加在处理的载玻片上,用培育基培育,时间通过预试验确定;
2、细胞长好后,用洗刷液洗2分钟×3次,室温下将其放入细胞固定液中固定30-60min,蒸馏水洗刷;
3、室温下用洗刷液充沛洗刷固定细胞,(干燥后-20℃冰冻保存2周以上)
4、杂交前将固定的细胞进行如下处理;顺次在70%,90%,100%的乙醇中浸泡,脱水每次5min,用二jia苯洗刷,除掉残留脂质顺次在100%,90%,70%乙醇中浸泡,进行再水化,每次5min,后浸泡于洗刷液中;
5、在37℃用胃蛋白酶溶液10min处理固定的细胞,以增加细胞对大分子试剂的通透性,再用洗刷液洗5min;
6、用1%甲醛固定10min,用洗刷液洗净。
二、留意:
1、所有溶液都必须用RNA酶抑制剂处理。
2、操作中重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。