蛋白酶K已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用弹性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血/渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。

值得注意的是，蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理,它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用,以增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时,都会对细胞的结构有一定的破坏,导致组织切片的脱落,细胞核的消失,从而影响杂交结果.EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用,解决上述出现的问题,并能达到理想的染色效果。