1.提蛋白

（不同细胞类型的蛋白或细胞不同部位的蛋白提取方法或有不同，需要提前查找资料）

我用的是凯基生物公司的全蛋白提取试剂盒 一般是取100 mg 标本 + 1 ml lysis buffer + 10 ul 磷酸酶抑制剂 + 10ul PMSF + 1 ul 蛋白酶抑制剂 放入研磨器研磨，直至研磨成匀浆（注意冰上操作，有的试剂盒说明在研磨时加液氮），倒入EP管，放入离心机离心，12,000 g / 5 min，取上清。

另一种提蛋白试剂，用RIPA buffer (Gibco) + 1% cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor (Sigma)

20mg样品（尽量吸尽PBS） + 150 ul RIPA 溶液

冰上放置5~30min（赶时间可短）

蛋白定量-BCA测定方法（酶标板操作）

（如果不同样品总蛋白表达量以及蛋白组分差异大，总蛋白调齐之后还需要看内参蛋白的表达是否一致，最后可根据内参蛋白调整上样量）

BSA标准品一般需用PBS稀释液稀释（按照protocol来）。释待测样品至合适浓度，使样品稀释液（稀释后浓度一般不超过测得标准品的最高浓度），总体积为20 μL。据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B ( 50:1 ) 配制适量BCA工作液，充分混匀，每孔加入200 μL BCA工作液。

37℃放置30分钟（可调整时间）后，以标准曲线0号管做参比，在562 nm波长下比色，记录吸光值。以蛋白浓度 ( μg/ul )为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。

绘制标准曲线 y = 0.554x+0.0034

据所测样品的吸光值（此处为y值）Average of triplicate， 代入y = 0.554x+0.0034 得到蛋白浓度x值，乘以稀释倍数。根据蛋白上样量确定体积（如上样总体积16ul (加 混匀的4x Laemmli+β-巯基乙醇 煮沸变性)，上样量20ug，测得蛋白浓度5ug/ul，则取蛋白提取液体积 volume = 20/5 = 4ul），补PBS 8ul，再加4x Laemmli 4ul, 使上样体积相等。一般99℃水浴变性5min（变性可尝试不同时间，如3min、7min或更长），保存于-80℃。

（4x Laemmli 也可换成 5x loading buffer）加入5x loading buffer (即80ul 样本 加 20ul loading buffer )，摇匀，可用封口膜封口 (防止煮沸时EP管口因压力高而弹开) 煮沸变性（温度时间根据蛋白可做相应调整）。

2. wb

2.1 配胶

蛋白分子量大小不同，所使用的分离胶浓度也不同，常用浓度有6%、8%、10%、12%，分子量越大，所用的胶浓度越低，蛋白电泳速度越快。浓缩胶浓度均为 5%。分离胶的选择：蛋白分子量很小时，推荐使用10-12%，例如蛋白分子量为 21kd 和 34kd ，选取的胶浓度为10%；分子量80kd，选10%；分子量180kd，选6%。

[电泳液也可用BIO-RAD 10x Tris/Glycine/SDS buffer, 直接取100ml buffer + 900ml 纯水稀释即可。配胶可用TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%或其它浓度]

加样之前先简单介绍一下。一般wb、免疫荧光、免疫组化等组织病理学实验样本要求是每组不低于3个，需要相互比较的组别加样时放于同一块胶上。测目标蛋白之前先跑内参蛋白，检测各样本的蛋白提取量是否相近。内参蛋白量一致，再测目标蛋白。一般我用GAPDH作为内参蛋白（不同组织有区别），分子量~35kd。marker作为指示剂可以显示目标蛋白所处的条带位置及大概分子量，一般加3～5ul。至于目标蛋白，不同蛋白表达量不同，一般10～20ug，可根据第一次的结果进行调整。

2.2 电泳

电泳时长一般1.5h，先用80v 跑~30min，使各样本处于同一水平，待marker开始分离后将电压调至120v 再跑~1h。待loading buffer提示快跑出分离胶时，准备配制转膜液。配方如图。

2.3 转膜（湿跑法）

转膜是整个wb过程中最重要的一步。Glycine14.1 g + Tris 3 g +800 ml 纯水配好后，放入冰袋预冷，之后加甲醇 800ml。PVDF膜一般为2 x 8 cm 大小。PVDF膜和胶要时刻保持湿润，不能干。将PVDF膜放入装有甲醇的培养皿中活化~15秒，再倒入转膜液。转膜时要注意赶走膜与胶之间的气泡。转膜板如下图，在两层滤膜之间依次放入胶和PVDF膜（胶对应转膜板黑色面/仪器黑色面-连接电源负极，PCDF膜对应转膜板透明面/白色面/仪器红色面-连接电源正极）。注意转膜仪器正负极与电源相对应。

转膜时长和蛋白分子量有关，一般100 kb以内的蛋白，转膜时长1kb / 1min，大于100kb，改为1kb / 1.5分钟。一般是恒流 200mA，加冰袋；分子量大时，可用300mA，隔1h 换1次冰袋，因为转膜过程会产生大量热量，避免仪器烧坏。

（半干转膜法）

可用BIO-RAD Trans-Blot Turbo 5x Transfer Buffer (1份 20ml) + ethanol (1份 20ml) + nanopure water (3份 60ml) (需预冷)

2A~2.5A，恒压25V，10min（可根据需要改变条件）BIO-RAD仪器。

2.4 封闭和敷一抗

将PVDF膜放入封闭液（1% milk in 1x TBST + 0.1% Tween 20 ）中，室温下封闭~1h，也可根据需要延长至1.5h。封口膜大小一般3.5 x 10.5cm（可用封闭盒，尽量用纯水或TBST清洗）。置于摇床上慢速摇~1h后，置于4℃冰箱过夜。

（验证抗体很重要）

2.5 敷二抗和显影

取出PVDF膜（条带），用TBST洗涤3次，5min /次。若抗体效价不是很好，可适当延长每次的洗涤时间。再用相同的封闭液稀释二抗，置于摇床上摇1h。之后取出条带再用TBST洗涤3次，5min /次。配显影液，我用的是MILLIPORE品牌的，比例1:1，注意避光(可用锡箔纸)。每条带滴约200ml 显影液。

显影成像时因不同曝光时间会影响成像效果，最好取欠曝光，适度曝光以及过度曝光多个曝光时间，取差异最大的图像。

tips: 刚从新鲜组织提前的蛋白记得摇匀分装，应尽量在早期多做点wb条带图，便于后期数据补充分析，提取的蛋白存放时间久以及反复冻融，会导致蛋白降解，影响结果的准确性。

wb房间没有空调，夏天温度太高导致胶很快就凝了，可以将玻璃板放在冰上预冷，冬天用纯水可以压平分离胶，夏天可以用异丙醇压平。

TEMED具有神经毒性和挥发性，应在通风口处使用，避免摇晃，避光低温存储。

因答主测量的蛋白分子量比较靠近，之前一块胶只转了一个蛋白，最近在想直接对整块胶进行转膜，对不同蛋白进行半定量分析，这样既能减少上样误差，还可以直观的看出不同蛋白间的变化趋势。所以试了下对整块胶进行转膜，加入两种抗体，此处一抗种属来源不同，因此二抗也不一样，最后条带结果并不理想。目前还在摸索是否为抗体浓度的因素。

另外，如果是发好的paper，建议将膜保留下来，注意保湿（可保存8～9个月），部分投稿杂志会要求作者提供。

今天面试，教授们提了一个问题，希望与大家共勉。如何确定wb中特异性抗体结合的蛋白就是我们要的目标蛋白，首先可以根据分子量大小判断，可以做共沉淀把目标蛋白拉下来送去做质谱。可以对膜上的蛋白做色谱和质谱联合分析，另外特异性染色也可以做，抗二抗的抗体可以购买或者自己制作。

通过向同学深入的学习，还可以做阴性对照和阳性对照。阴性对照（确定不表达或极微量表达目标蛋白的样品），比如基因敲除动物，对动物做DNA鉴定，确定没有该蛋白对应的基因序列，再提取蛋白做wb。阳性对照（确定表达目标蛋白的样品），比如某种模型或正常组就是会比该种实验模型的表达高，可以做wb进行比较。

技术是一种手段，但是严谨的科研思维以及善于探索很重要。