考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,最小可测2.5μg/mL蛋白质,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
考马斯亮蓝G250是由于与蛋白质的结合反应十分迅速,常用来作为蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量流程:
该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1、Bradford浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml85%的磷酸,然后,用蒸馏水补充至200ml,此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2、标准曲线蛋白质样本的准备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的,也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3、将待测样本溶于缓冲溶液中,该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同。
4、按1:4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液,如出现沉淀,过滤除去。
5、每个样本加5ml稀释的染料结合溶液,作用5~30min。染液与蛋白质结合后,将由红色变为蓝色,在595nm波长下测定其吸光度。注意,显色反应不得超过30min。
6、根据标准曲线计算待测样本的浓度。