ELISA试剂盒实验中每一个步骤都尤为重要,细节不容忽视,它是实验成功的关键与否;在这里方便各位了解,更好的完成实验,对ELISA试剂盒的实验原理和操作步骤做出以下分析,供大家参考:
实验原理:
用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素,经过*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
实验前的准备工作:
1、准备好所有实验额外所需物品,如试管 吸头 移液器 离心机等;
2、确定试剂盒在有效期内;
3、仔细阅读说明书;
4、按说明书确定所有试剂齐全;
5、标本制备要规范,每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备,尽量分装做备份;
6、根据检测标本数量确定所需试剂的量;
7、按说明书将所用试剂盒平衡至室温,配制所需试剂。
ELISA试剂盒的操作步骤:
1、使用前,将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产生加样上的误差;
2、根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1:1稀释后加入50ul于反应孔内;
3、加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育1小时;
4、甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次;
5、每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育30分钟;
6、甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次;
7、每孔加入底物A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37℃温育10分钟。避免光照;
8、取出酶标板,迅速加入50ul终止液,加入终止液后应立即测定结果;
9、在450nm波长处测定各孔的OD值。