酶标记抗体法的实验原理总体来说和荧光素标记抗体法的原理类似，分为直接法和间接法，其原理基本相同，但敏感性不同。
一、直接法
直接法是将酶（如HRP）标记在特异性抗体（*抗体）上，然后用酶标记抗体直接与相应原特异性结合，形成抗原—抗体—HRP复合物，然后后用酶底物DAB-H202显色。该法的优点是简单、步骤少，省时、特异性高、非特异性染色轻：缺点是敏感性差，因为一个抗原决定簇只结合一个HRP分子（假设一个抗体分子与一个HRP分子结合）。另外，一种标记抗体也只能检测一种抗原。若要检测多种抗原，就必须标记每一种特异抗体，这样既麻烦又不经济。目前此法很少应用，但在单克隆抗体制备过程中，为了更特异地筛选单抗，仍常用此法。
二、间接法
间接法也称夹心法，是直接法的简单改进，将酶示踪物标记在二抗上，再与*抗体（已与相应抗原反应形成复合物的IgG）反应，然后进行显色反应。此法要求第二抗体与特异性抗体（一抗）应是不同种属的动物产生，如特异性抗体（一抗）是兔抗人IgG，酶标记抗体（二抗）则可以是羊抗兔抗体。
间接法与直接法比较有以下优点：
1、应用面较宽，仅标记一种二抗就可以检测众多相同的*抗体，例如众多一抗为兔来源，只要标记一种抗兔二抗就可用于所有抗兔一抗的检测，不需要对每种特异性抗体进行标记；
2、敏感性增加，*抗体的工作浓度在直接法的基础上进一步稀释；
3、可以商品化购置；
4、可以设计各种对照。
