酶联免疫吸附实验 ELISA

 ELISA原理 --操作规则（新手适用）

酶联免疫吸附实验 ELISA

    ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。

 一．实验原理

     酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）--待测抗体（抗原）--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产物成正比。

    用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。

     辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

   ELISA的基本原理有三条：

    （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；
    （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 

  （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

二、实验方法

    基本方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。
　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

   基本方法二　用于检测未知抗体的间接法：
    用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。
    加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）
    于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,后一遍用DDW洗涤。
    其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

     （二） 酶与底物

       酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。

免疫技术常用的酶及其底物

     *  终止剂为2mol/L H2SO4

     ** 终止剂为2 mol/L柠檬酸， 不同的底物有不同的终止剂。

     可催化下列反应： HRP+H2O2→复合物 复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 ——为无色底物, 供氢体； A—— 为有色产物。

  （三） ELISA常用的四种方法

   1．直接法测定抗原

      将抗原吸附在载体表面；

      加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；

      加底物。底物的降解量＝抗原量。

   2．间接法测定抗体

     将抗原吸附于固相载体表面；

      加抗体, 形成抗原-抗体复合物；

      加酶标抗体；

      加底物。 测定底物的降解量＝抗体量。

   3．双抗体夹心法测定抗原

     将抗原免疫种动物获得的抗体吸附于固相表面;

     加抗原，形成抗原-抗体复合物;

     加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;

     加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）;

     加底物。底物的降解量＝抗原量。

   4. 竞争法测定抗原

     将抗体吸附在固相载体表面;

     （1） 加入酶标抗原；

     （2）,（3）加入酶标抗原和待测抗原；

     加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。

三．仪器和材料

    1. 聚苯乙烯微量细胞培养板-酶标板（平板, 40孔, 96孔）。

    2. 酶联免疫检测仪，50ul或100ul加样器。

    3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000。

    4. 包被液：0.05mol/L PH9.6碳酸盐缓冲液,4℃保存。 Na2CO3 0.159克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。

     5. 稀释液：同洗涤缓冲液。 【或者牛血清白蛋白(BSA)0.1g加入洗涤缓冲液至100ml；或者加羊/兔血清与洗涤液配成5-10%】

     6. 洗涤缓冲液：0.01mol/L PH7.4  PBS-Tween-20, 于４℃保存。 NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween-20（0.05%）0.5ml。蒸馏水加至1000ml。

     7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。

     8. 邻苯二胺溶液（底物）：临用前配制， 0.1M 柠檬酸（2.1g/100ml）6.1ml,  0.2M Na2HPO4·12H2O（ 7 .163g/100ml）6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40ul。

     9. 终止液：2mol/L H2SO4。 蒸馏水178.3ml逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。

四.  操作步骤

    1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。

    2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

   3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。

   4. 洗涤同2。

   5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。

   6. 洗涤同2。

   7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。

   8. 洗涤同2。

   9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10--15分钟。

   10. 加终止液：每孔50微升。

   11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。